伦纳德·尼莫伊最著名的角色是在《星际迷航》中扮演“半瓦肯人、半人类”的史波克，并引领了《星际迷航》的流行手势和流行台词：“生生不息，繁荣昌盛（Live Long and Prosper）”，他在片中的尖耳朵、立眉造型、冷血的瓦肯人思维模式也成为极客粉丝们追逐的时尚。近些年来，“史波克船长”因在美剧《生活大爆炸》中被谢耳朵奉为人生第一偶像而被更多中国观众所熟悉，事实上《生活大爆炸》中谢耳朵的室友Leonard的名字就是在向伦纳德·尼莫伊（Leonard Nimoy）致敬。

《星际迷航》系列从1966年起以剧集的形式开始播放，1969年剧集停播，开始改编电影登上大银幕，迄今为止已被拍摄为12部电影，尼莫伊曾因扮演史波克的角色而被提名艾美奖。

剧集《星际旅行：初代》终止后，他开始出演《虎胆妙算》系列，从1969年至1971年他在该系列中扮演一名魔术师和化装大师的间谍。

1984年，已经导演过一些电视剧的尼莫伊开始试水导演电影，并成功地执导了电影《星际旅行3：石破天惊》和《星际旅行4：抢救未来》。

1987年，他导演了当年最上座的电影《三个奶爸一个娃》。

在新版的《星际迷航》中，当时已经79岁高龄的尼莫伊出演了平行世界的老年spock

2009年，79岁高龄的伦纳德·尼莫伊在J·J·艾布拉姆斯导演的《星际迷航》第11集中出演了平行世界中的老年史波克船长，与扎克瑞·昆图扮演的新版史波克船长上演了感人的对手戏。不过在这一次出演后，尼莫伊表示他决定退出演艺圈，并表示：“扎克瑞·昆图是个很棒的演员，是时候给他一些空间了，这样对他更公平些。”

除了扮演史波克，尼莫伊在舞台剧、写作方面也有建树，曾在1995年出版自传《I am Spock》，同时他还是一位出色的摄影师。